近期，安諾優達單細胞測序產品在生命科學和生物醫學領域的應用不斷拓展，連續發布了兩篇合作文章，上期我們介紹了單細胞測序揭示卵巢癌新型耗竭T細胞標志物的相關內容，為卵巢癌患者的治療提供了新的思路，本期讓我們一起來探究小鼠腸隱窩電離輻射損傷修復多重效應的相關研究吧~

2023年10月，中國醫學科學院放射醫學研究所張俊伶副研究員、樊賽軍研究員在知名期刊Redox Biology（IF=11.4）發表題為“Single-cell RNA sequencing of intestinal crypts reveals vital events in damage repair and the double-edged sword effect of the Wnt3/β-catenin pathway in irradiated mice”的文章。通過對小鼠腸隱窩的單細胞轉錄組研究，探討了腸隱窩輻射損傷修復中的重要事件和Wnt3/β-catenin通路的多重效應，提出了腸隱窩干細胞和巨噬細胞之間通過MIF-CD74/CD44通路的相互作用可能加劇高劑量輻射暴露小鼠的小腸損傷的新觀點。安諾優達為本研究合作作者，并提供了10× 單細胞建庫測序和分析服務。

研究背景

放療是癌癥治療的重要手段，但是放療通常伴隨著對正常組織的損傷，一定程度上限制了其應用。電離輻射誘導的分化細胞死亡和腸隱窩干細胞丟失是輻射損傷主要原因之一。輻射暴露后，腸上皮細胞的損傷修復呈動態變化，該過程中涉及的關鍵信號通路仍需進一步闡明。

材料選擇

特異性無病原體C57BL/6雄性小鼠腸隱窩樣本；

樣本共設置五組，每組小鼠3只；

分別為13Gy—輻射暴露后1天組、13Gy—輻射暴露后3天組、13Gy—輻射暴露后5天組、15Gy—輻射暴露后3天組（Gy為放射治療劑量單位）。

測序策略

10x 單細胞轉錄組測序&Illumina PE150

研究內容

單細胞轉錄組揭示13Gy腹部輻射暴露后腸隱窩細胞比例和基因表達的動態變化

輻射暴露后，腸隱窩基底部細胞（crypt base columnar，CBC）的再生對整個腸上皮的修復至關重要。選取13Gy腹部輻射暴露后不同時間點的小鼠腸隱窩進行單細胞轉錄組測序。研究者發現CBC細胞和瞬時擴增細胞（transient amplification，TA）比例呈顯著變化（圖1 A-D）。繼續聚焦到基因表達，CBC和TA細胞顯著富集的差異表達基因具有相似性，這些基因與干細胞標記物、細胞周期、細胞凋亡、細菌防御等相關（圖1 J）。值得注意的是，CBC和TA細胞中許多上調基因參與了細菌的防御和抗菌免疫反應，提示細菌感染是輻射損傷后的嚴重威脅之一，宿主細胞對細菌的防御反應可能是13Gy腹部輻射暴露后DNA損傷修復期間的重要事件。

圖1 13Gy腹部輻射暴露后小鼠腸隱窩細胞組成及基因表達動態

輻射暴露后TA細胞簇呈現高度異質性的特點

為進一步探究放療對CBC和TA細胞分化的影響，研究者進行了不同組中CBC和TA細胞分化軌跡分析：未經輻照的CBC細胞接近潛伏時間的末尾，與之相反，輻射暴露后的TA細胞幾乎出現在潛伏時間的所有位置，提示TA細胞可能是輻射損傷修復過程中的關鍵亞群。RNA速率分析結果同樣證實了TA細胞各亞群的分化特點（C3和C7亞群向EC簇轉化，C5亞群向goblet簇轉化，C8亞群向Clu+revSC簇轉化，圖2 G-I）。以上結果提示，輻射暴露后腸隱窩TA細胞具備高度異質性，可能分化為成熟細胞或去分化成為干細胞。

圖2 輻射照射后腸隱窩細胞分化軌跡分析

Wnt3/β-catenin通路在輻射誘導的腸損傷中具有雙重作用

隨著輻射劑量的增加腸道損傷加劇，15Gy輻射暴露后的第3天，小鼠腸隱窩的CBC細胞仍然遭受嚴重的損傷。激活Wnt信號通路可以使輻射誘導的腸道損傷再生，并維持腸道干細胞穩態。Wnt配體（Wnt3a、Wnt4和Wnt5）可能參與了腸隱窩輻射損傷的修復。同時藥物測試的動物實驗表明，經典的Wnt通路可能參與了15Gy輻射暴露后的腸道輻射損傷過程。

15Gy腹部輻射暴露可能通過腸干/祖細胞與巨噬細胞之間的MIF-CD74/CD44相互作用誘導小鼠死亡

應用單細胞數據進行細胞通訊分析，研究所有簇間受體-配體的相互作用。Wnt配體主要與CBC、TA細胞等受體信號相互作用，Wnt3/β-catenin通路在腸干/祖細胞損傷修復中發揮作用，這種作用是把“雙刃劍”，可能影響部分其他細胞，導致更嚴重的損傷。

圖3 細胞通訊分析各亞群間的相互作用

進一步分析提示，15Gy腹部輻射暴露可能誘導巨噬細胞中CD44的上調，并增加MIF與CD44的結合。在輻射暴露后第2天用單克隆抗體阻斷CD44可有效減少小鼠死亡。通過清除氧自由基來改善輻射損傷的治療策略可以抑制巨噬細胞中CD44的表達，促進腸上皮中MIF與CD44的結合，從而修復腸道輻射損傷。

結論

本研究揭示了高劑量腹部輻射暴露誘導小鼠死亡的潛在機制，Wnt3/β-catenin信號通路促進了輻照暴露小鼠腸隱窩干細胞/祖細胞的恢復，誘導巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）的釋放，進一步修復了電離輻射誘導的腸損傷。隨著輻射劑量的增加，巨噬細胞上的CD44被激活，為MIF信號轉導提供受體，啟動炎癥級聯反應，最終引起炎癥風暴導致小鼠死亡，為探索輻射損傷防護救治提供新思路。

參考文獻

Tong Yuan, Junling Zhang, Yue Zhao, Yuying Guo, Saijun Fan,Single-cell RNA sequencing of intestinal crypts reveals vital events in damage repair and the double-edged sword effect of the Wnt3/β-catenin pathway in irradiated mice,Redox Biology,2023．